[導(dǎo)讀] 隨著人們對(duì)自身基因遺傳信息的了解和掌握，使得基因檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展和完善，基因檢測(cè)技術(shù)也得到了迅猛發(fā)展，下面就和小編一起看看這些年測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程。

　　測(cè)序技術(shù)的每一次變革，都是對(duì)基因組研究，疾病醫(yī)療研究，藥物研發(fā)等領(lǐng)域的巨大推動(dòng)作用。從1977年代DNA測(cè)序技術(shù)(Sanger法)，發(fā)展至今三十多年時(shí)間，測(cè)序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展，從代到第三代，測(cè)序讀長(zhǎng)從長(zhǎng)到短，再?gòu)亩痰介L(zhǎng)。雖然就當(dāng)前形勢(shì)看來(lái)第二代短讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在測(cè)序市場(chǎng)上仍然占有著很大的優(yōu)勢(shì)位置，但第三測(cè)序技術(shù)也已在這一兩年的時(shí)間中快速發(fā)展著。

　　根據(jù)原理的不同，人們將測(cè)序技術(shù)發(fā)展分為三個(gè)階段，代，sanger測(cè)序。第二代，高通量測(cè)序(NGS)。第三代，單分子/納米孔測(cè)序。由于三代測(cè)序技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)用的領(lǐng)域也不盡相同，代測(cè)序技術(shù)仍未被淘汰，目前的測(cè)序市場(chǎng)是三代測(cè)序技術(shù)并存的局面。

代：sanger測(cè)序

　　代測(cè)序技術(shù)，主要基于 Sanger雙脫氧終止法的測(cè)序原理，結(jié)合熒光標(biāo)記和毛細(xì)管陣列電泳技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)測(cè)序的自動(dòng)化，基本方法是鏈終止或降解法，人類基因組計(jì)劃就是基于一代測(cè)序技術(shù)。代的Sanger測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是，測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)，能達(dá)到800-1K bp，且測(cè)序用時(shí)短，只需要幾十分鐘即可完成一次測(cè)序，測(cè)序準(zhǔn)確度高準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，目前仍是測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn);缺點(diǎn)是通量低、成本高，影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。

　　因而代測(cè)序技術(shù)并不是理想的測(cè)序方法。經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)開(kāi)發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測(cè)序技術(shù)誕生了。第二代測(cè)序技術(shù)大大降低了測(cè)序成本的同時(shí)，還大幅提高了測(cè)序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，以前完成一個(gè)人類基因組的測(cè)序需要3年時(shí)間，而使用二代測(cè)序技術(shù)則僅僅需要1周，但在序列讀長(zhǎng)方面比起代測(cè)序技術(shù)則要短很多。

第二代：高通量測(cè)序(NGS)

　　高通量測(cè)序技術(shù)(又稱為下一代測(cè)序，Next Generation Sequencing，NGS)自2005年454公司推出臺(tái)基于焦磷酸測(cè)序二代測(cè)序儀開(kāi)始，到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列，高通量測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷了十幾年的技術(shù)發(fā)展過(guò)程，NGS測(cè)序平臺(tái)也經(jīng)歷了一系列的收購(gòu)和合并，終形成主要三家測(cè)序平臺(tái)，包括：Illumina的Solexa平臺(tái)、Life Technologies的 Ion Torrent平臺(tái)和華大基因的Complete Genomics平臺(tái)。

　　1.Illumina平臺(tái)

　　由于其技術(shù)成熟，平臺(tái)之間高度互補(bǔ)性與交叉性，使得其在短讀長(zhǎng)測(cè)序上大占優(yōu)勢(shì)，是目前應(yīng)用廣泛的NGS平臺(tái)。目前其占據(jù)了測(cè)序儀市場(chǎng)約70%的*。

　　2.Life Technologie平臺(tái)

　　Life公司Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)采用的為半導(dǎo)體測(cè)序原理，其在非堿基多聚體(non-homopolymer)的測(cè)序上正確率與其它NGS平臺(tái)相差無(wú)幾，而對(duì)于連續(xù)堿基的檢測(cè)還不夠完善，在檢測(cè)同一堿基連續(xù)出現(xiàn)時(shí)的數(shù)量可能會(huì)有所誤差。相對(duì)于其他平臺(tái)，測(cè)序通量較小，平臺(tái)數(shù)量也較少。

　　3.Complete Genomics平臺(tái)

　　Complete Genomics平臺(tái)采用了高密度DNA納米芯片技術(shù)，在芯片上嵌入DNA納米球，然后用復(fù)合探針-錨定分子連接(cPAL)技術(shù)來(lái)讀取堿基序列。雖然這些技術(shù)非常準(zhǔn)確，但該技術(shù)在應(yīng)用上大的限制可能就是其過(guò)短的讀長(zhǎng)。

　　高通量測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷了十幾年的飛速發(fā)展，人類基因組測(cè)序成本已經(jīng)從人類基因組計(jì)劃的約30億美元降到了1000美元左右。目前二代測(cè)序設(shè)備在通量、準(zhǔn)確度上都有了較大的提高，同時(shí)測(cè)序成本也隨之大幅度下降，成為商用測(cè)序的主流。

第三代：?jiǎn)畏肿?納米孔測(cè)序

　　測(cè)序技術(shù)在近兩年中又有新的里程碑，Helicos公司的Heliscope單分子測(cè)序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)，被認(rèn)為是第三代測(cè)序技術(shù)。與前兩代技術(shù)相比，他們大的特點(diǎn)是單分子測(cè)序，測(cè)序過(guò)程無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，Heliscope技術(shù)和SMRT技術(shù)利用熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)序，而納米孔單分子測(cè)序技術(shù)利用不同堿基產(chǎn)生的電信號(hào)進(jìn)行測(cè)序。

　　由于第二代技術(shù)存在短讀長(zhǎng)和耗時(shí)長(zhǎng)的缺陷，人們希望第三代測(cè)序技術(shù)能解決這些缺陷，第三代測(cè)序技術(shù)通過(guò)現(xiàn)代光學(xué)、高分子、納米技術(shù)等手段來(lái)區(qū)分堿基信號(hào)差異的原理，以達(dá)到直接讀取序列信息的目的，三代測(cè)序設(shè)備在DNA 序列片段讀長(zhǎng)上優(yōu)于二代設(shè)備，但在準(zhǔn)確度上較二代設(shè)備差，目前尚未*成熟，市場(chǎng)應(yīng)用面還不算廣，未來(lái)隨著技術(shù)的改善，三代測(cè)序設(shè)備將更為穩(wěn)定和成熟。

　　第三代測(cè)序優(yōu)勢(shì)：

　　1)第三代基因測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，如Pacific Biosciences 公司的 PACBIO RS II 的平均讀長(zhǎng)達(dá)到 10kb，可以減少生物信息學(xué)中的拼接成本，也節(jié)省了內(nèi)存和計(jì)算時(shí)間。

　　2)直接對(duì)原始DNA樣本進(jìn)行測(cè)序，從作用原理上避免了 PCR 擴(kuò)增帶來(lái)的出錯(cuò)。

　　3)拓展了測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，二代測(cè)序技術(shù)大部分應(yīng)用基于DNA，三代測(cè)序還有兩個(gè)應(yīng)用是二代測(cè)序所不具備的：個(gè)是直接測(cè)RNA的序列，RNA的直接測(cè)序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。第二個(gè)是直接測(cè)甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同，根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的C是否甲基化。

　　4)三代測(cè)序在ctDNA，單細(xì)胞測(cè)序中具有很大的優(yōu)勢(shì)：ctDNA含量非常低，三代測(cè)序技術(shù)靈敏度高，能夠?qū)τ?ng以下做到監(jiān)測(cè);在單細(xì)胞級(jí)別：二代測(cè)序要把DNA提取出來(lái)打碎測(cè)序，三代測(cè)序直接對(duì)原始DNA測(cè)序，細(xì)胞裂解原位測(cè)序，是三代測(cè)序的殺手應(yīng)用。

　　第三代測(cè)序缺陷：

　　1)總體上單讀長(zhǎng)的錯(cuò)誤率依然偏高，成為限制其商業(yè)應(yīng)用開(kāi)展的重要原因;第三代基因測(cè)序技術(shù)目前的錯(cuò)誤率在15%-40%，極大地高于二代測(cè)序技術(shù)NGS的錯(cuò)誤率(低于1%)。不過(guò)好在三代的錯(cuò)誤是*隨機(jī)發(fā)生的，可以靠覆蓋度來(lái)糾錯(cuò)(但這要增加測(cè)序成本)。

　　2)三代測(cè)序技術(shù)依賴DNA聚合酶的活性。

　　3)成本較高，二代Illumina的測(cè)序成本是每100萬(wàn)個(gè)堿基0.05-0.15美元，三代測(cè)序成本是每100萬(wàn)個(gè)堿基0.33-1.00美元。

　　4)生信分析軟件也不夠豐富。

　　三代測(cè)序和二代測(cè)序相比較，第二代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是成本較之一代大大下降，通量大大提升，但缺點(diǎn)是所引入PCR過(guò)程會(huì)在一定程度上增加測(cè)序的錯(cuò)誤率，并且具有系統(tǒng)偏向性，同時(shí)讀長(zhǎng)也比較短。第三代測(cè)序技術(shù)是為了解決第二代所存在的缺點(diǎn)而開(kāi)發(fā)的，它的根本特點(diǎn)是單分子測(cè)序，不需要任何PCR的過(guò)程，這是為了能有效避免因PCR偏向性而導(dǎo)致的系統(tǒng)錯(cuò)誤，三代讀長(zhǎng)超長(zhǎng)，準(zhǔn)確低，費(fèi)用高，但因讀長(zhǎng)長(zhǎng)，利于組裝和發(fā)現(xiàn)unique reads潛在優(yōu)勢(shì)明顯，但是劣勢(shì)也限制了三代測(cè)序的商業(yè)應(yīng)用。

　　未來(lái)前景

　　目前，第二代的基因測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序(NGS)是市場(chǎng)商用主流。第三代的單分子/納米孔測(cè)序?qū)⑹俏磥?lái)的大勢(shì)所趨，但是預(yù)計(jì)在將來(lái)5-10年內(nèi)二、三代基因測(cè)序會(huì)共存，但二代測(cè)序仍將是測(cè)序市場(chǎng)商業(yè)應(yīng)用主流。